多光子显微成像滤光技术的研究进展

作者： Traci R. Jensen, Gregg W. Jarvis, Robert L. Johnson, Jr.

机构： Omega Optical, Inc., Brattleboro, VT, USA

原文来源： Proceedings of SPIE Vol. 4262, Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences, 2001

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摘要

一种新的光学干涉滤光片沉积技术被证明可提供双光子荧光应用所需的深度阻隔和扩展透射区域。该技术允许沉积比以前更多层数的高相位厚度涂层，实现理论上大于光学密度9的阻隔水平。我们展示了在双光子荧光应用中具有高透射率和深度阻隔的短波通边缘滤光片和带通滤光片的实例。还展示了一种在近红外具有高反射率、在可见光区域具有扩展高透射区域的二向色镜。

关键词： 光学滤光片；干涉滤光片；电介质薄膜；双光子荧光；短波通滤光片；带通滤光片

1. 引言

双光子激发荧光显微镜是一种相对较新的技术，需要与传统单光子激发不同的独特光学滤光片解决方案。通常需要一个二向色滤光片将入射激光光与荧光信号分离，还需要第二个滤光片进一步衰减散射激光光。通常需要高的近红外阻隔比，因为大多数应用使用飞秒脉冲钛:蓝宝石激光器。由于激发和发射波长之间可能有高达400nm的分离，透射边缘陡度不像单光子激发那样重要。最重要的滤光片特性是近红外的深度阻隔、可见区域的高透射率，以及滤光片组件的最小自荧光。

近年来，光学干涉滤光片沉积技术有所改进，可以沉积高相位厚度涂层和高光谱对比度。Omega开发了一种新的沉积技术（以下称为Alpha技术），允许构建具有深度阻隔和扩展高透射区域的短波通和长波通边缘滤光片。传统上，光学滤光片基于四分之一波堆叠设计，其中交替的高和低折射率材料层以四分之一波光学厚度沉积在玻璃基底上。随着沉积更多层，可以实现更高的阻隔和更陡峭的边缘斜度。使用光学监测可以沉积的层数是有限的，因为滤光片的生长通常在反射带中监测。Alpha技术避免了在反射带中监测，因此可以沉积的层数实际上仅受薄膜应力特性的限制。硫化锌和冰晶石（Na₅Al₃F₁₄）是可见区域涂层的理想材料对，具有良好的抗拉应力和压应力平衡[7]。在使用ZnS/冰晶石薄膜沉积中应用Alpha技术，可以实现超过100层的涂层。多层涂层的另一种理想材料组合是TiO₂和SiO₂，它们还具有耐久性和耐磨性的优势。

2. 短波通边缘滤光片

Alpha技术用于制造由交替的ZnS和冰晶石层组成的短波通边缘滤光片。这些材料使用灯丝加热坩埚源在真空钟罐中蒸发到玻璃基底上。这些是软且吸湿的材料，因此必须用环氧树脂粘合盖玻片保护免受环境侵害。短波通边缘滤光片在浮法玻璃上构建，没有吸收玻璃组件。

图1展示了一种短波通边缘滤光片的实例，该滤光片在750-975nm区域阻隔（反射），透射低至475nm。该滤光片由41层组成，最大阻隔大于光学密度5。由于分光光度计信噪比的限制，阻隔测量限制在约光学密度5（0.001%透射）。

我们可以使用商用薄膜软件计算阻隔水平。TFCalc 3.4 (Software Spectra, Inc.)用于模拟图1所示滤光片的透射和阻隔曲线。结果显示，最大光学密度达到9.3，在约820nm和860nm之间的波长处。阻隔在736nm至970nm范围内大于光学密度5。

使用相同材料，可以制造在较低波长处阻隔并透射至400nm的滤光片。图3显示了45层短波通边缘滤光片的透射和阻隔曲线。在650-750nm波长范围内阻隔大于光学密度5。在这种情况下，ZnS的吸收边缘决定了滤光片截止边缘的位置，约在390nm。为了实现在400nm以下的透射，需要使用在紫外区域具有较低吸收边缘的不同材料。氧化铪已被证明是紫外区域使用的良好高折射率材料[8]，吸收边缘约在215nm。

3. 带通滤光片

通过组合Alpha短波通和长波通边缘滤光片，可以制造具有高透射率、陡峭斜率和深带入外阻隔的带通滤光片。滤光片通带的中心波长位置由边缘的放置决定。每个边缘的陡度可以通过独立调整长波通和短波通组件滤光片中的层数来控制。

图4显示了这种滤光片的透射和阻隔曲线。通带的中心波长为468nm，带宽（半峰全宽）为40nm。峰值透射率约为80%，带外阻隔优于光学密度6。该滤光片是由约100层交替ZnS和冰晶石组成的浸没涂层。在700-1100nm区域提供额外阻隔的是2mm厚的BGG22吸收玻璃。带通滤光片将透射感兴趣的荧光信号，同时阻挡散射激光以及所有其它干扰波长

4. 二向色滤光片

图5展示了一种用于双光子荧光显微镜应用的二向色镜。该滤光片设计用于在45°入射角下使用，将激光线反射并将荧光信号透射。它在大于750nm的波长处高反射，在约400nm以下的整个可见区域高透射。该滤光片是由TiO₂和SiO₂组成的暴露涂层，它们是硬质氧化物涂层。由于不需要深度阻隔，使用标准四分之一波堆叠设计。未涂覆侧应用了硬质氧化物抗反射（AR）涂层以提高可见透射率。为确保最小自荧光，滤光片沉积在熔融石英基底上。通过改变沉积监测波长，可以移动边缘位置以适应其它激光线。然而，二氧化钛的吸收边缘位于约400nm。为了实现更远的紫外的透射，必须使用吸收边缘低于TiO₂的材料。

5. 总结

一种新的沉积技术已应用于双光子荧光应用的短波通边缘和带通滤光片的生产。该技术允许沉积大量电介质层，因此实现了散射激光的深度阻隔。短波通边缘滤光片具有宽透射区域和约100nm宽的阻隔区域，为可调激光源提供了灵活性。展示了一种在通带中具有高透射率和深带入外阻隔的带通滤光片。这对于激光激发波长固定且只有一个感兴趣荧光信号的应用来说是理想的。展示了一种在近红外具有高反射率、在可见光区域具有高透射率的二向色镜，用于显微镜应用。

参考文献

1. Wei J, et al. Anal. Chem. 72, pp. 1360-1363, 2000.
2. Shear JB, et al. Anal. Chem. 68, pp. 1778-1783, 1996.
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6. Macleod HA. Thin Film Optical Filters, McGraw-Hill, New York, 1989.
7. Rancourt JD. Optical Thin Films User's Handbook, McGraw-Hill, New York, 1987.
8. Jensen TR, et al. Soc. Vac. Coaters 43rd Tech. Conf. Proc., 2000.